對于基因治療產(chǎn)品，宿主細胞殘留DNA（HCD）是一種可能存在于最終的產(chǎn)品中的工藝相關(guān)雜質(zhì)，其殘留問題受到了生物制藥用戶的廣泛關(guān)注，存在制瘤性和感染性?，F(xiàn)有研究表明，可能引發(fā)致病的功能基因至少在200 bp以上，因此殘留DNA片段越大，風險等級越高。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在《Chemistry,Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》中明確指出非致瘤性HCD的片段要小于200 bp；國家藥品評審中心（CDE）在2022年5月發(fā)布《基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》，明確指出生產(chǎn)若使用了腫瘤細胞系（如 Hela 細胞）、致瘤細胞系，或攜帶有致瘤基因、病毒來源序列的細胞（如 HEK 293T 細胞），HCD的片段要小于200 bp，從而減少致瘤性和感染性風險。因此基因治療終產(chǎn)品中需要合適的方法檢測HCD的片段大小分布情況。

目前SGS實驗室有PA800 Plus 毛細管電泳儀，配備有UV,PDA及LIF檢測器，其中LIF檢測器可以用來快速檢測質(zhì)粒DNA的片段大小分布。

▉ 檢測原理：

核酸分子中糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈負離子化狀態(tài)；加反向電壓時，在電泳過程中從負極向正極移動；帶電荷的核酸通過凝膠向正極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、凝膠濃度、電場等因素影響；核酸與染料結(jié)合后會在特定波長下激發(fā)熒光信號。

CGE-LIF方法就是基于質(zhì)粒DNA片段這樣的特性，在毛細管內(nèi)充滿含有熒光染料的凝膠，在毛細管的兩端賦予電流，在相同的電泳條件下，讓不同大小的質(zhì)粒DNA片段逐一到達檢測窗口，從而達到分離和檢測的目的。再經(jīng)LIF檢測器記錄指定波長下激發(fā)的熒光信號，最終根據(jù)面積歸一化法得到各組分的百分比。

CE工作流程圖：

▉ 案例分析

DNA Ladder圖譜

DNA Ladder各峰遷移時間的重復(fù)性(n=6)

樣品結(jié)果分析

通過樣品與DNA Ladder對比，可以快速確定樣品HCD片段大小是否＜200bp，從而判斷該樣品是否合格。

▉ 結(jié)論

根據(jù)DNA Ladder各峰遷移時間比對，RSD在2.0%以內(nèi)，重復(fù)性好，各峰的分離度好，靈敏度高，可以快速檢測質(zhì)粒DNA的片段大小分布。

 
SGS生物分析表征團隊擁有多年經(jīng)驗，主導(dǎo)或參與過多種生物分析方法開發(fā)與驗證，包括大分子蛋白類藥物、單抗/多抗類藥物、ADC類藥物、核酸類藥物等，檢測項目包含糖基化、電荷異質(zhì)性/分子大小等；參照GMP和ISO/IEC17025質(zhì)量體系要求建立了獨立生物分析實驗室，配置有LC-Q-TOF、LC-MS/MS、GC-MS 、HPLC/UPLC、毛細管電泳儀、酶標儀、圓二色光譜儀等高精尖儀器設(shè)備，SGS一站式生物制品研發(fā)分析與服務(wù)平臺，符合國際質(zhì)量標準，可為客戶提供生物分析表征專業(yè)的綜合解決方案。